Закон Бугера — Ламберта — Бера: формула, смысл и пределы линейности

Закон Бугера — Ламберта — Бера — основной закон светопоглощения, на котором держится количественная спектрофотометрия. Он связывает то, сколько света поглотил раствор, с концентрацией вещества в нём, и на нём построен каждый градуировочный график.

Но у закона есть границы. Бывает, что раствор приготовлен идеально, а Abs на дисплее ведёт себя так, будто прибор шутит. Причина чаще всего — нарушение линейности, и пока вы не научились его распознавать, под угрозой любые измерения. Ниже — объяснение простыми словами, формула с расшифровкой величин и признаки, по которым видно, что линейность нарушена.

Суть закона простыми словами

Луч света проходит через кювету с окрашенным раствором, и часть света по пути поглощают молекулы вещества. Чем больше молекул встретится лучу, тем меньше света дойдёт до детектора прибора.

Больше молекул луч встретит в двух случаях: раствор концентрированнее или слой раствора толще. Отсюда и суть закона: поглощение растёт пропорционально концентрации вещества и длине пути света в растворе. Удвоили концентрацию — оптическая плотность удвоилась. Взяли кювету вдвое длиннее — тот же эффект.

Закон носит три имени, потому что складывался постепенно. Пьер Бугер (1729) и Иоганн Ламберт (1760) описали зависимость ослабления света от толщины слоя, Август Бер (1852) — от концентрации вещества. Поэтому в учебниках встречаются и отдельные закон Бугера — Ламберта и закон Бера, а объединённый называют основным законом светопоглощения.

Формулировка и формула закона Бугера — Ламберта — Бера

Формулировка: оптическая плотность раствора при прохождении через него монохроматического света прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества и толщине слоя раствора.

A = ε · l · c

Что означает каждая величина:

• A (в отечественной литературе часто D) — оптическая плотность, на дисплее прибора — Abs. Величина безразмерная.
• ε — молярный коэффициент поглощения, л/(моль·см). Показывает, насколько сильно вещество поглощает свет данной длины волны. Зависит от природы вещества, длины волны, растворителя и температуры.
• l — толщина поглощающего слоя, то есть оптический путь кюветы, см. Для кюветы 10 мм это 1 см.
• c — молярная концентрация вещества, моль/л.

Как оптическая плотность связана с пропусканием

Прибор измеряет интенсивность света: I₀ — прошедшего через холостую пробу, I — через пробу. Их отношение — пропускание: T = I / I₀. Оптическая плотность — десятичный логарифм обратной величины: A = lg(I₀ / I) = −lg T.

Логарифм нужен потому, что каждый слой раствора одинаковой толщины поглощает одну и ту же долю дошедшего до него света. Пропускание связано с концентрацией нелинейно, а оптическая плотность — прямо пропорционально. Поэтому для количественного анализа измеряют именно A.

При A = 2 до детектора доходит лишь 1 % света, при A = 3 — 0,1 %. Чем слабее полезный сигнал, тем сильнее на результат влияют шум и посторонний свет.

Оптическая плотность и концентрация: откуда берётся прямая

В реальном анализе вещество, длина волны и кювета от пробы к пробе не меняются. Значит, ε и l постоянны, и закон превращается в пропорцию A = k · c. Это уравнение прямой, и на нём построен градуировочный график.

На практике концентрацию редко считают по справочному ε. Надёжнее измерить серию стандартных растворов в тех же условиях, что и пробы, и провести через точки прямую: так в коэффициент k попадают особенности вашего прибора, реактивов и кювет. Уравнение обычно имеет вид A = k · C + b, где b отражает остаточное поглощение холостой пробы. Построить такую прямую по своим точкам и сразу посчитать пробу можно в калькуляторе градуировочного графика.

Ещё одно следствие закона — правило аддитивности: оптические плотности невзаимодействующих веществ на одной длине волны складываются. Поэтому ноль устанавливают по холостой пробе — из результата вычитается поглощение растворителя и реактивов.

И последнее: ε сильно зависит от длины волны. Измеряют обычно в максимуме полосы поглощения — там чувствительность наибольшая, а небольшая неточность установки длины волны меньше всего меняет результат.

Пределы применимости: когда закон перестаёт работать

Закон строго выполняется в идеальных условиях: монохроматический свет, разбавленный истинный раствор, неизменное состояние вещества. В лаборатории так бывает не всегда, поэтому линейность нужно контролировать. Вот что важно знать:

1. Закон работает корректно только в определённом диапазоне концентраций. У каждой методики есть рабочий диапазон, внутри которого зависимость A от c остаётся прямой.
2. Слишком концентрированный раствор уводит прибор в зону искажения. Оптическая плотность растёт уже не пропорционально количеству вещества: график загибается, и концентрация по прямой получается заниженной.
3. Линейность нарушают даже небольшие отклонения — в концентрации, толщине слоя раствора или настройках прибора.

Химические причины

При высокой концентрации молекулы начинают взаимодействовать: ассоциируют, образуют комплексы, диссоциируют. Меняется форма вещества в растворе, а с ней и коэффициент поглощения. К тому же ведут сдвиг pH, неполное протекание реакции образования окрашенного соединения и разрушение окраски со временем.

Приборные причины

Закон выведен для монохроматического света, а прибор пропускает через кювету узкую, но всё же полосу длин волн. Чем она шире и чем круче в этом месте спектр вещества, тем заметнее отклонение — особенно на фотоколориметрах со светофильтрами. Второй фактор — рассеянный свет, попадающий на детектор в обход пробы. При высоких оптических плотностях его доля становится заметной, и график выполаживается.

Оптические причины

Прибор считает поглощением любое ослабление луча. Муть, взвесь и пузырьки рассеивают свет и завышают оптическую плотность — подробнее в статье о мутных растворах в спектрофотометрии. Флуоресцирующие вещества, наоборот, добавляют свет к прошедшему и занижают результат. Оптический путь кюветы и её посадка в держателе тоже должны быть одинаковыми для стандартов и проб.

Как увидеть, что линейность нарушена, и что делать

Признаки, на которые стоит смотреть:

• верхние точки градуировочного графика ложатся ниже прямой, линия загибается к оси концентраций;
• коэффициент детерминации падает, хотя стандарты готовили аккуратно;
• после разбавления пробы вдвое оптическая плотность уменьшается не вдвое;
• значения A подходят к верхней границе шкалы, повторные измерения «прыгают».

Самая простая проверка — разбавлением. Разведите пробу в известное число раз и измерьте снова: в линейной области результат с учётом разбавления совпадёт с исходным в пределах погрешности. Как развести пробу без потери точности, мы разбирали в статье о разведении проб.

Что делать, если вышли за пределы:

• развести пробу так, чтобы её оптическая плотность попала внутрь диапазона стандартов;
• взять кювету с меньшим оптическим путём — оптическая плотность уменьшится пропорционально;
• не продлевать градуировочную прямую за последнюю точку стандарта: там линейность ничем не подтверждена;
• проверить длину волны, нулевание и чистоту кювет.

Если методика не задаёт иного, держитесь середины рабочего диапазона: при очень малых A велика относительная погрешность отсчёта, при больших до детектора доходит слишком мало света. Типичные симптомы, включая зашкал и «плывущие» показания, собраны в разборе ситуаций, когда кажется, что прибор врёт.