Оптическая плотность раствора: определение, формула, коэффициенты и OD600

Оптическая плотность — безразмерная величина, равная десятичному логарифму отношения интенсивности света, падающего на образец, к интенсивности прошедшего света: A = lg(I₀/I). В спектрофотометрии это основной измеряемый сигнал: пока выполняется закон светопоглощения, оптическая плотность раствора пропорциональна концентрации вещества.

Сам закон и то, зачем в формуле логарифм, разобраны в статье о законе Бугера — Ламберта — Бера. Здесь — о самой величине: названия и обозначения, пересчёт из пропускания, от чего она зависит, коэффициенты поглощения, рабочий диапазон и оптическая плотность бактериальных культур.

Что такое оптическая плотность: определение и формула

Государственная фармакопея РФ (ОФС.1.2.1.1.0003, XV издание) определяет оптическую плотность A как безразмерную величину — десятичный логарифм величины, обратной пропусканию, для монохроматического излучения: A = lg(1/T) = lg(I₀/I). Пропускание T = I/I₀ — доля света, прошедшего через образец. В ГОСТ 8.654-2016 «Фотометрия. Термины и определения» та же величина названа оптической плотностью по пропусканию (п. 2.3.22).

I₀ на практике — не свет лампы, а свет, прошедший через кювету с раствором сравнения: фармакопея предписывает измерять относительно того же растворителя, в котором растворено вещество. Как правильно установить ноль — в статье об измерении на спектрофотометре.

IUPAC различает десятичную и натуральную оптическую плотность: натуральная Aₑ = ln(I₀/I) больше десятичной в ln 10 ≈ 2,303 раза, и путать их нельзя.

Как пересчитать пропускание в оптическую плотность

Для пропускания в процентах: A = 2 − lg T% и T% = 100 · 10^(−A). Условный пример: T = 25 % даёт A = 2 − 1,398 = 0,602; A = 0,250 соответствует T ≈ 56,2 %. Записывают A с тремя знаками после запятой: по методическому пособию НГУ, абсолютная погрешность измерения оптической плотности — ориентировочно 0,002–0,005.

Absorbance, optical density, D, Abs: как правильно называть величину

В международной терминологии величина называется absorbance (символ A). В действующей редакции Золотой книги IUPAC (5.0.0) optical density и extinction приведены как её синонимы. Глоссарий IUPAC по аналитической спектроскопии (рекомендации 2019 г.) называет extinction нерекомендуемым термином, а optical density не упоминает.

В русских нормативных документах — ГОСТ 8.654-2016 и фармакопее — это «оптическая плотность», и в протоколе такой термин корректен. Путаница — в обозначениях: в ГОСТ 8.654-2016 это D с индексом, в фармакопее — A, на дисплеях — A или Abs, в микробиологии — OD.

Ещё одна ловушка — слово «коэффициент». В ГОСТ 8.654-2016 коэффициент поглощения α (п. 2.3.4) — отношение поглощённого потока к падающему, то есть доля света, а не ε из закона Бера. Термина «коэффициент оптической плотности» нет ни в этом ГОСТ, ни в ОФС: встретив его в методике, уточните по формуле, о какой величине речь.

От чего зависит оптическая плотность раствора

Формула A = ε · l · c называет три фактора: коэффициент поглощения, длину оптического пути и концентрацию. Но за ε стоит ещё целый набор условий.

• Вещество и длина волны. Зависимость A от λ — спектр поглощения; подробнее — в статье о спектре поглощения и выборе длины волны.
• Длина оптического пути. Фармакопея по умолчанию предполагает кювету 1 см; в кювете 5 мм тот же раствор даст вдвое меньшую A.
• Растворитель и среда. ε меняется с растворителем и ионным фоном. Оптическая плотность самого растворителя относительно воздуха, по фармакопее, не должна превышать 0,4, желательно — 0,2.
• Температура. По пособию НГУ, изменение температуры на 1 градус может менять ε порядка 0,5 %.
• pH и равновесия. Если вещество существует в нескольких формах, A зависит от их соотношения, а оно — от pH и состава раствора.
• Прибор. Спектрофотометр выделяет полосу 0,1–6 нм, фотоколориметр — 20–50 нм (пособие НГУ), а определение A подразумевает монохроматический свет. Об устройстве приборов — в обзоре «Спектрофотометрия».

Молярный и удельный коэффициенты поглощения

Молярный коэффициент поглощения ε, л/(моль·см), равен A/(l · c); названия extinction coefficient и molar absorptivity глоссарий IUPAC 2019 г. не рекомендует. По пособию НГУ, у интенсивно поглощающих веществ он около 10⁴–10⁵, у запрещённых переходов (d–d, f–f, n–π*) — меньше 10², у полос переноса заряда в комплексах — 10³–10⁴ и выше. От ε зависит чувствительность: при ε = 10⁴ л/(моль·см), кювете 1 см и минимальной измеряемой A = 0,1 определяемая концентрация — 10⁻⁵ моль/л.

В фармакопейных статьях используют удельный показатель поглощения A¹%₁см — оптическую плотность раствора концентрацией 1 г/100 мл в кювете 1 см. Формулы ОФС: A = A¹%₁см · cₘ · l (cₘ — в г/100 мл) и A¹%₁см = 10 · ε / M, где M — относительная молекулярная масса.

Условный пример: при M = 200 и ε = 1,0·10⁴ л/(моль·см) A¹%₁см = 10 · 10 000 / 200 = 500. Раствор 1,0 мг в 100 мл в кювете 1 см даст A = 500 · 0,0010 · 1 = 0,50. Проверка: 0,010 г/л : 200 г/моль = 5,0·10⁻⁵ моль/л, ε · c = 0,50.

Значение коэффициента зависит от единиц концентрации: беря его из справочника, сверяйте единицы и условия. Надёжнее градуировка по стандартам на своём приборе — её удобно рассчитать в калькуляторе градуировочного графика.

Какой диапазон оптической плотности рабочий и почему

При малой A интенсивности I и I₀ почти равны: абсолютная погрешность мала, относительная велика. При большой A до детектора доходит малая доля света, и растут обе погрешности.

Классический расчёт приведён в учебнике Д. Харви со ссылкой на работу Rothman, Crouch, Ingle (1975). Если абсолютная погрешность отсчёта пропускания s_T постоянна (разрешение шкалы, тепловые приёмники), относительная погрешность концентрации равна по модулю s_c/c = 0,4343 · s_T / (T · lg T) и минимальна при A = 0,4343, то есть при T ≈ 36,8 %.

Таблица — условный расчёт относительной погрешности концентрации по формулам Харви с его параметрами: 0,434 — ответ лишь для одного типа шума. У фотонных приёмников минимум сдвигается к A ≈ 0,96, а между 0,5 и 2 погрешность почти не меняется; нестабильность лампы и неодинаковая установка кюветы сказываются в основном при малых A.

Практические границы: пособие НГУ считает оптимальным в подавляющем большинстве случаев диапазон A от 0,1 до 1, тот же интервал Харви называет для погрешности ±1–2 %. Фармакопея требует держаться рабочего диапазона, указанного производителем, и избегать количественных измерений при A больше 2,0. Пробу за границами разбавляют или берут другую кювету.

Оптическая плотность мутных сред и бактериальных культур (OD600)

В суспензии частицы рассеивают свет мимо детектора, и прибор выдаёт кажущуюся оптическую плотность — подробнее в статье о мутных растворах. В глоссарии IUPAC 2019 г. это experimental absorbance — оптическая плотность без поправок на рассеяние, отражение и люминесценцию.

На этом построен контроль роста культур по OD600. Как показали Myers с соавторами (BMC Biophysics, 2013), у непигментированных бактерий вроде E. coli ослабление света определяется в основном рассеянием. 600 нм — соглашение: подходит любая область вдали от полос поглощения пигментов, а эта длина волны прижилась отчасти потому, что её легко получить и измерить.

Отсюда зависимость от прибора: сколько рассеянного света всё же попадёт на детектор, определяют оптическая схема и угол приёма фотоприёмника. В той же работе одна культура E. coli на двух спектрофотометрах давала расхождение OD более 40 %, на пяти приборах разброс превышал 30 %, а у растворов красителей расхождение двух приборов доходило до 25 %.

Линейный участок у суспензий короче: на приборе, где красители подчинялись закону Бера примерно до 2,5, культура E. coli отклонялась от прямой уже при OD ≈ 0,8. Авторы напоминают, что пробы часто разбавляют до OD ниже 0,5, а холостой пробой советуют брать супернатант культуры. Коэффициенты «OD — колониеобразующие единицы» у разных организмов различались на два порядка, поэтому универсального «OD600 = 1 — столько-то клеток» нет.

На что обратить внимание на практике

• Записывайте A вместе с длиной волны, длиной пути кюветы и составом раствора сравнения.
• В УФ-области следите за поглощением растворителя: погрешность там, по пособию НГУ, обычно в два-три раза выше, чем в видимой.
• Не сравнивайте OD600 с разных приборов без калибровки и не переносите чужие коэффициенты «OD — клетки».

Если показания «плывут», зашкаливают или не повторяются, пройдитесь по типичным причинам, по которым кажется, что прибор врёт.