Спектр поглощения и длина волны: как выбрать аналитическую длину волны

Спектр поглощения — это зависимость поглощения света веществом от длины волны: по горизонтали обычно откладывают длину волны, по вертикали — оптическую плотность или молярный коэффициент поглощения. По спектру находят λmax — длину волны максимума полосы поглощения, на которой обычно и ведут количественное измерение.

Ниже — как снять спектр, почему мерят в максимуме и когда от этого отступают, как окраска раствора подсказывает область поглощения, на что влияет ширина щели и что фармакопея требует от шкалы длин волн. В конце — алгоритм выбора аналитической длины волны.

Что такое спектр поглощения и полоса поглощения

Молекула поглощает квант света, когда его энергия совпадает с разностью энергий основного и возбуждённого состояний. Электронные уровни связаны с колебательными и вращательными подуровнями, и переходов так много, что разделить их не удаётся. Поэтому, по ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» (ГФ XV), в спектре видны полосы, а не линии.

Полоса поглощения — участок спектра, где вещество интенсивно поглощает излучение. Её описывают положением максимума λmax, интенсивностью (εmax — молярный коэффициент поглощения в максимуме) и полушириной — шириной на половине высоты. Чем больше εmax и уже полоса, тем выше чувствительность. О величине на оси ординат — в статье об оптической плотности раствора.

Фармакопея называет две рабочие области: ближнюю ультрафиолетовую, примерно 180–400 нм, и видимую, примерно 400–800 нм. Вещества, поглощающие только в ультрафиолете, бесцветны — например, бензол и азотная кислота. Пока выполняется закон Бугера — Ламберта — Бера, форма спектра не зависит от концентрации и толщины слоя и максимум не смещается.

Как снять спектр поглощения на спектрофотометре

Спектр снимают относительно раствора сравнения, выставив «ноль» — коррекцию базовой линии во всём диапазоне. Способов три:

• сканирование — по ОФС оператор подбирает диапазон, скорость и ширину щели так, чтобы получить нужное разрешение без потери отношения сигнал/шум;
• диодная матрица — весь спектр регистрируется сразу, разрешение обычно фиксировано;
• по точкам — длину волны меняют вручную; в учебном примере ИГМУ шаг 5 нм, у максимумов и минимумов — 1 нм. Если прибор не хранит базовую линию, ноль ставят на каждой длине волны.

Концентрацию стандарта подбирают так, чтобы оптическая плотность в максимуме не превышала 2,0: при больших значениях ОФС советует избегать количественных измерений. Растворитель должен быть прозрачен: относительно воздуха не выше 0,4, желательно меньше 0,2. По пособию ИГМУ, неблагоприятна для анализа область, где прибор переключает источники излучения. Для ультрафиолета нужны УФ-источник — по ОФС, например, дейтериевая лампа — и кварцевые кюветы; это учитывают при подборе спектрофотометра.

Почему измеряют в максимуме поглощения (λmax)

В большинстве методик аналитическую длину волны ставят в λmax, и тому три причины.

1. Чувствительность. В максимуме оптическая плотность сильнее всего меняется на единицу концентрации.
2. Устойчивость к ошибке шкалы. Вершина почти плоская, и небольшая неточность установки длины волны практически не сказывается. На крутом склоне та же неточность даёт систематическую ошибку.
3. Линейность. Через кювету идёт узкая полоса длин волн, а немонохроматический свет всегда даёт отрицательное отклонение от закона Бера. Оно мало, если ε в пределах полосы почти постоянен, — на пологой вершине.

Из нескольких максимумов пособие ИГМУ советует выбирать длинноволновый, а пологий предпочитать острому: острый пик чувствительнее к ширине щели и к точности шкалы.

Когда длину волны выбирают не в максимуме

Правило максимума работает, пока на этой длине волны поглощает только определяемое вещество.

• Реагент сам окрашен. Измеряют там, где разность оптических плотностей окрашенного соединения и реагента наибольшая; раствор сравнения готовят с тем же количеством реагента.
• Мешает другой компонент. Берут длину волны, где определяемое вещество поглощает сильно, а мешающее — пренебрежимо мало. При полном перекрывании спектров переходят к анализу смеси на нескольких длинах волн.
• Две равновесные формы. Если часть вещества переходит в форму со сдвинутым максимумом, измерение в λmax занижает результат. Выход — изобестическая точка: длина волны, где спектры форм пересекаются и поглощение одинаково.

Высокая оптическая плотность — не повод уходить на склон, где растут ошибки от шкалы и щели: пробу разводят или берут кювету короче. Длину волны, заданную методикой, не меняют.

Цвет раствора и длина волны поглощения: таблица

Раствор окрашен, потому что часть белого света он поглощает, а мы видим остальное. Цвет раствора и поглощённого света — дополнительные: жёлтый раствор поглощает синий свет, пурпурный — зелёный. Светофильтр фотоколориметра берут цвета поглощаемого света.

Источник — учебное пособие Е. А. Илларионовой и И. П. Сыроватского «Фотометрические методы и их применение в фармацевтическом анализе» (ИГМУ, 2024, табл. 5); семь строк совпадают с ОФС «Фотоколориметрия» ГФ XIV. Это ориентир: в указаниях ТПУ жёлтым растворам сопоставлена область 420–440 нм. В пособии НГУ приведён пример двух красных растворов — бромидного комплекса золота(III) и бипиридильного комплекса железа(II), максимумы которых разнесены более чем на 100 нм. Точный ответ даёт только спектр.

Спектральная ширина щели: как она влияет на измерение

Из выходной щели монохроматора выходит пучок с некоторым интервалом длин волн — это спектральная ширина щели; она зависит от механической ширины щели и дисперсии монохроматора. Чем щель шире, тем ниже измеренная оптическая плотность в максимумах и выше в минимумах; для узких полос искажение сильнее.

По ОФС щель должна быть малой по сравнению с полушириной полосы поглощения и при этом как можно шире, чтобы света хватало. Критерий: дальнейшее сужение не меняет оптическую плотность.

Количественный ориентир даёт учебник Д. Харви «Analytical Chemistry 2.1»: отклонение от закона Бера невелико, если эффективная ширина полосы пропускания прибора меньше одной десятой естественной ширины полосы поглощения. Условный пример: для полосы шириной 40 нм на половине высоты подходит щель до 4 нм. Значение фиксированной щели ищите в документации прибора.

Светофильтр вместо монохроматора

У фотоколориметра полоса шире: пособие НГУ приводит 20–50 нм против 0,1–6 нм у спектрофотометров. Максимум пропускания фильтра должен совпадать с максимумом поглощения раствора. Без спектра фильтр подбирают опытом: два раствора разной концентрации измеряют со всеми фильтрами и берут тот, где разность оптических плотностей наибольшая. Подробнее — в статье о фотоколориметре и спектрофотометре.

Точность установки длины волны: что требует фармакопея

ОФС.1.2.1.1.0003 ГФ XV допускает для приборов с кюветами отклонение шкалы ±1 нм ниже 400 нм и ±3 нм от 400 нм и выше, для детекторов ВЭЖХ — ±2 нм. Проверять рекомендуется минимум на двух длинах волн по краям рабочего диапазона, при той же ширине щели, что и в работе.

Для растворов и стёкол это максимумы поглощения, для ламп — линии излучения. Реактив ОФС — гольмия перхлората раствор 4 % в растворе хлорной кислоты 14,1 %; у сертифицированных образцов значения сверяют с их документацией. ОФС упоминает и встроенный контроль шкалы в некоторых приборах. Как вписать проверку в работу лаборатории — в статье о проверке спектрофотометра, все проверки по ОФС — в обзоре о спектрофотометрии.

Как выбрать аналитическую длину волны: алгоритм

1. Если длина волны задана методикой, работайте на ней; найденный максимум должен совпасть с указанным в пределах ±2 нм (ОФС).
2. Снимите спектр стандарта с наибольшей концентрацией серии, чтобы A в максимуме не превышала 2,0.
3. Снимите спектры реагента, холостой пробы и, если возможно, пробы без определяемого вещества.
4. Найдите максимум: предпочтительны пологий и длинноволновый, вне зоны переключения ламп.
5. При помехах сместите длину волны: к наибольшей разности с реагентом, к минимуму поглощения мешающего вещества или в изобестическую точку.
6. Сужайте регулируемую щель, пока оптическая плотность не перестанет меняться.
7. Проверьте линейность по серии стандартов.
8. Запишите длину волны, щель и прибор — зачем, объяснено в статье о параметрах измерения.

Типичные ошибки

• выбирать длину волны по цвету раствора, не сняв спектр;
• уходить на склон полосы вместо разведения пробы;
• снимать спектр при одной щели, а измерять при другой.