Мутный раствор в спектрофотометрии: почему растёт оптическая плотность

Мутный раствор — частая причина того, что оптическая плотность «живёт своей жизнью»: всё сделано правильно, а показания завышены и меняются от повтора к повтору. То же бывает с маслами, густыми жидкостями и неоднородными пробами.

Дело не в приборе, а в том, что не все жидкости ведут себя при измерении одинаково. Спектрофотометр любит прозрачные растворы. Разберём, почему мутность раствора искажает результат, как это распознать и что делать с такой пробой.

Почему мутный раствор завышает оптическую плотность

Спектрофотометр не видит, что происходит со светом внутри кюветы. Он сравнивает, сколько света вошло в раствор и сколько дошло до детектора, и по этой разнице считает оптическую плотность (D, на дисплее — Abs).

В прозрачном растворе свет ослабляется за счёт поглощения — это и есть полезный сигнал. В мутном к нему добавляется светорассеяние: взвешенные частицы отклоняют часть лучей в стороны, и до детектора они не доходят. Для прибора потерянный свет выглядит так же, как поглощённый. В результате прибор фиксирует не только поглощение, и данные искажаются — как правило, в сторону завышения.

Такую величину называют кажущейся оптической плотностью: в ней сложены настоящее поглощение вещества и потери на рассеяние. Разделить их по одному числу на дисплее нельзя.

Масла, эмульсии и густые пробы: в чём подвох

Нестандартные жидкости мешают измерению по-разному:

• мутные растворы и суспензии рассеивают свет на взвешенных частицах;
• масла частично отражают свет, а масляная плёнка на стенках кюветы добавляет свои потери;
• эмульсии — капли одной жидкости в другой — рассеивают свет так же, как взвесь;
• густые пробы плохо перемешиваются, удерживают пузырьки и легко остаются неоднородными.

Общая беда всех таких проб — неоднородность. Если состав в кювете неодинаков, прибор измеряет только тот слой, через который прошёл луч, а соседний может быть совсем другим.

Как понять, что мутность раствора влияет на результат

Заподозрить светорассеяние стоит, если:

• оптическая плотность слишком высокая без видимой причины;
• результат нестабилен при повторных измерениях;
• раствор визуально мутный или неоднородный;
• значения меняются после перемешивания.

Есть и приборная подсказка. Рассеяние на мелких частицах сильнее в коротковолновой области, поэтому спектр мутной пробы поднимается в сторону коротких длин волн, а там, где ни определяемое вещество, ни реактив не должны поглощать, оптическая плотность не опускается до нуля. Если прибор позволяет снять спектр или измерить при второй длине волны вне полосы поглощения, такой фон сразу виден.

Похожие симптомы дают и пузырьки воздуха: они тоже рассеивают свет. Как отличить их от взвеси, мы разбирали в статье про пузырьки в кювете.

Как измерить мутный раствор на спектрофотометре

Универсального приёма нет: выбор зависит от методики и от того, что именно вы определяете. Рабочих подходов четыре.

Подготовка пробы

Фильтрование или центрифугирование убирают лишнюю взвесь. Но сначала проверьте, разрешает ли это методика: если нужно общее содержание вещества, а часть его находится во взвеси, вместе с ней вы уберёте и часть определяемого компонента. Кроме того, фильтр может удерживать вещество из раствора, поэтому первые порции фильтрата обычно отбрасывают.

Разбавление

Разбавление снижает влияние рассеяния и помогает вывести оптическую плотность в линейный диапазон, где выполняется закон Бугера — Ламберта — Бера. Разбавляйте тем растворителем, который указан в методике, и учитывайте коэффициент разведения при расчёте. Как не внести ошибку на этом шаге, читайте в статье о разведении проб.

Подбор метода анализа

Иногда прямое измерение мутной пробы не даёт корректного результата, и нужна реакция с образованием окрашенного комплекса. Сильно окрашенное соединение даёт большой полезный сигнал, и доля рассеяния в нём становится меньше. Если методика предусматривает раствор сравнения на основе самой пробы без окрашивающего реактива, он дополнительно компенсирует собственную окраску и мутность матрицы — при условии, что мутность в обеих кюветах одинакова.

Контроль однородности

Даже небольшое разделение фаз — масляный слой сверху или осадок на дне — влияет на результат. Если по методике пробу измеряют без отделения взвеси, перемешивайте её одинаково перед каждым заполнением кюветы и измеряйте сразу, пока частицы не осели.

Работа с нестандартными жидкостями — уровень выше базового. Здесь мало нажать кнопку: нужно понимать, что именно измеряет прибор.

Когда нужно измерить саму мутность

Бывает и обратная задача: мутность не мешает анализу, а её как раз и нужно определить — например, в воде. Для этого есть отдельные методы: турбидиметрия, где измеряют ослабление проходящего света, и нефелометрия, где регистрируют свет, рассеянный под углом. Такие измерения ведут по своим методикам с градуировкой по стандартам мутности.