Спектрофотометрия: принцип метода, УФ и видимая область, требования ОФС

Спектрофотометрия — это метод анализа, в котором измеряют, какую долю света определённой длины волны поглощает вещество, и по этому поглощению узнают, что за вещество в пробе и сколько его. Государственная фармакопея РФ определяет спектрофотометрию в ультрафиолетовой и видимой областях как метод молекулярной абсорбционной спектроскопии; измерения обычно ведут в диапазоне примерно 180–800 нм.

Ниже — принцип метода, УФ- и видимая области, отличие от фотоколориметрии, качественный и количественный анализ и проверки прибора по фармакопее. Детали — в отдельных статьях по ссылкам.

Что такое спектрофотометрия и фотометрический метод анализа

Оптические методы, основанные на поглощении излучения, различают по поглощающим частицам: атомы — атомно-абсорбционный анализ, взвешенные частицы — турбидиметрия и нефелометрия, молекулы в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях — молекулярный абсорбционный анализ: спектрофотометрия, фотоколориметрия, ИК-спектроскопия.

Спектрофотометрию и фотоколориметрию объединяют в группу фотометрических методов анализа: в обоих случаях концентрацию находят по светопоглощению однородного раствора. Разница — в свете. Спектрофотометрия измеряет поглощение монохроматического излучения, фотоколориметрия — полихроматического, в полосе, которую пропускает светофильтр видимой области.

В терминах IUPAC спектроскопия — изучение систем по излучению, с которым они взаимодействуют, а спектрометрия — измерение этого излучения. Спектрофотометрия в глоссарии IUPAC стоит в том же ряду: измерение интенсивности излучения в зависимости от длины волны или частоты.

На чём основан метод: поглощение света и закон Бугера — Ламберта — Бера

Молекула поглощает свет, если энергия кванта равна разности энергий основного и возбуждённого состояний: валентный электрон переходит на более высокий уровень. Из-за колебательных и вращательных подуровней переходов много, и вместо отдельных линий получаются широкие полосы поглощения. По фармакопее они характерны для сопряжённых хромофорных систем в молекуле.

Прибор сравнивает свет, падающий на образец и прошедший через него. Пропускание — их отношение: T = I / I₀. Оптическая плотность — десятичный логарифм обратной величины: A = lg(1/T) = lg(I₀/I). Величина безразмерная, в терминологии IUPAC — absorbance. Подробнее — в статье об оптической плотности раствора.

С концентрацией её связывает закон Бугера — Ламберта — Бера: A = ε · c · l, где ε — молярный коэффициент поглощения, л/(моль·см), c — концентрация, моль/л, l — оптический путь, см. Фармакопея оговаривает условия: раствор прозрачный и разбавленный, мешающих физико-химических факторов нет. IUPAC добавляет приборное условие: спектральная ширина полосы света должна быть узкой по сравнению с шириной полос в спектре вещества. Формулу и причины отклонений мы разбирали в статье о законе Бугера — Ламберта — Бера.

В фармакопейных статьях используют удельный показатель поглощения A(1 %, 1 см) — оптическую плотность раствора 1 г/100 мл в кювете 1 см при определённой длине волны. Тогда A = A(1 %, 1 см) · c · l с концентрацией в г/100 мл, а A(1 %, 1 см) = 10 · ε / M, где M — относительная молекулярная масса.

УФ-спектрофотометрия и видимая область: в чём разница

Фармакопея называет две рабочие области: ближнюю ультрафиолетовую, примерно 180–400 нм, и видимую, примерно 400–800 нм.

В видимой области измеряют окрашенные растворы. У гидратированных ионов молярные коэффициенты поглощения низкие, поэтому ион обычно переводят в окрашенный комплекс фотометрической реакцией. Разница бывает на порядки: у редкоземельных элементов в соляной кислоте ε порядка 1–10 л/(моль·см), у их комплексов с арсеназо III — (30–90)·10³. Так, по ГОСТ 4011-72 железо в питьевой воде связывают с сульфосалициловой кислотой и измеряют при 400–430 нм.

В органическом анализе чаще всего работают в УФ-области, в неорганическом — и в УФ, и в видимой. Требования к материалам в ультрафиолете жёстче: стекло для УФ непригодно, кюветы нужны кварцевые. Растворитель должен быть прозрачен: по ОФС его оптическая плотность относительно воздуха — не более 0,4, желательно менее 0,2.

Как устроен спектрофотометр и чем он отличается от фотоколориметра

По ОФС спектрофотометр включает источник излучения, монохроматор, линзы и зеркала, держатель образца (кювета или оптоволоконный зонд), детектор и компьютерную обработку данных. В двухлучевых приборах оптика формирует второй луч для канала сравнения — подробнее в статье об однолучевом и двухлучевом спектрофотометре.

Главное отличие от фотоколориметра — способ выделить длину волны. В спектрофотометре это монохроматор с дифракционной решёткой или призмой, в фотоэлектроколориметре (ФЭК) — светофильтр. Фотоколориметр работает в полосе шириной в десятки нанометров (в учебных пособиях — от 20 до 100 нм в зависимости от светофильтра), и в расчёт входит средний коэффициент поглощения εср, меньший ε. Спектрофотометр позволяет снять спектр, поставить длину волны в максимум полосы и работать в УФ. Подробное сравнение — в статье о фотоколориметре и спектрофотометре.

Качественный анализ: идентификация вещества по спектру

Спектр поглощения — зависимость оптической плотности от длины волны. Его вид определяется строением вещества, поэтому спектр служит для идентификации. ОФС называет три способа подтвердить подлинность:

• сравнить спектр пробы со спектром раствора стандартного образца: должны совпасть положения максимумов, минимумов, плеч и точек перегиба;
• сверить длины волн максимумов и минимумов с указанными в фармакопейной статье: расхождение обычно не более ±2 нм;
• сравнить отношение оптических плотностей при двух длинах волн.

Условия съёмки заметно влияют на форму спектра, поэтому сравнивают спектры, снятые в одинаковых условиях. Как снять спектр и выбрать аналитическую длину волны, рассказываем в статье о спектре поглощения и длине волны.

Количественное определение методом спектрофотометрии

Для градуировочного графика длину волны берут вблизи максимума поглощения, а стандарты — с перекрытием возможных концентраций в пробах. Практикум УрФУ советует 6–8 точек, при нелинейной зависимости — 10–12.

Метод стандарта фармакопея называет более точным и надёжным, чем расчёт по удельному показателю, применение которого нужно обосновывать. Метод добавок выручает, когда определяют малые количества вещества на фоне больших количеств посторонних, и требует строгого соблюдения закона светопоглощения — подробнее в статье о методе добавок.

На что обратить внимание на практике

• Проверяйте линейность заранее: по ОФС даже в монохроматическом свете возможны отклонения из-за диссоциации, ассоциации и комплексообразования, и тогда считают по экспериментальной зависимости, а не по формуле.
• Избегайте количественных измерений при A выше 2,0; значения пробы и раствора сравнения должны быть в рабочем диапазоне, указанном производителем прибора.
• Если методика не говорит иного, измеряют при комнатной температуре в кювете 1 см против того же растворителя, в котором растворена проба.
• Кюветы для пробы и раствора сравнения с одним растворителем должны давать одинаковое пропускание; если нет, разницу учитывают.

Что требует от прибора ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»

Действующая редакция — ОФС.1.2.1.1.0003 Государственной фармакопеи РФ XV издания. Она утверждена приказом Минздрава России от 20.07.2023 № 377 и введена с 1 сентября 2023 года взамен ОФС.1.2.1.1.0003.15. Прибор проверяют весь период эксплуатации; периодичность и объём проверок определяют по ОФС «Квалификация аналитического оборудования».

Для количественного определения минимальный перечень — четыре проверки: правильность шкалы длин волн, правильность шкалы оптической плотности, фотометрическая линейность и рассеянный свет. Разрешение или ширину щели проверяют, если этого требует фармакопейная статья. Для идентификации перечень короче.

Рассеянный свет, по IUPAC, — излучение, которое идёт через прибор не обычным путём и попадает в спектр на другой длине волны, а также свет в обход образца. Критерий «A не менее 3,0» значит, что прибор должен показать пропускание не выше 0,1 %.

Эти проверки относятся к квалификации оборудования. Поверка средства измерений — отдельная метрологическая процедура, о ней — в статье о поверке спектрофотометра.

Где применяется спектрофотометрия

• Фармацевтика. По ОФС — качественный и количественный анализ лекарственных средств, вспомогательных веществ, упаковочных материалов при разработке, производстве, изучении стабильности.
• Хроматография. В ВЭЖХ спектрофотометрия служит способом детектирования: детекторы для УФ- и видимой областей и диодно-матричные детекторы.
• Анализ воды по стандартизованным методикам с окрашенными комплексами — как железо по ГОСТ 4011-72.
• Исследования. Спектрофотометрически изучают комплексообразование — стехиометрию и устойчивость комплексов, кинетику реакций, константы диссоциации.